腸道微生物研究中T-RFLP分析技術(shù)的運用論文
摘要：限制性末端片段長度多態(tài)性分析技術(shù)（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP）具有高通量，低成本，低勞動力等特點，是微生物生態(tài)學(xué)家在探索群落結(jié)構(gòu)，功能及其動態(tài)變化中的一項實用方便的工具。自2012年至今，T-RFLP在腸道微生物領(lǐng)域研究方向不斷拓寬，隨后T-RFLP技術(shù)被更多的應(yīng)用于人體相關(guān)疾病與腸道微生物關(guān)系的研究中。盡管T-RFLP技術(shù)仍存在不足，但隨著16Sr RNA基因序列數(shù)據(jù)庫和引物的改進，數(shù)據(jù)生成和分析統(tǒng)計工具的運用，T-RFLP最終將能在各個領(lǐng)域體現(xiàn)其價值，為人類疾病研究事業(yè)帶來貢獻。
關(guān)鍵詞：限制性末端片段長度多態(tài)性分析；腸道菌群；動態(tài)變化；多樣性
1 T-RFLP 技術(shù)簡介
1.1 T-RFLP 技術(shù)原理
T-RFLP分析技術(shù)是一種利用對細菌基因組中的保守序列（如16Sr DNA）的T-RFs長度的多態(tài)性分析進而實現(xiàn)對細菌分型的群落研究技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是根據(jù)靶序列的保守區(qū)設(shè)計通用引物，以熒光標(biāo)記引物的5‘末端，并用限制性內(nèi)切酶對目標(biāo)片段進行酶切，隨后以待分析樣的總DNA為模板進行PCR擴增，再選用合適的限制性內(nèi)切酶消化擴增產(chǎn)物。由于核苷酸序列在不同菌的擴增片段中存在差異，酶切位點也不盡相同，據(jù)此得到不同長度的限制性片段。最后對消化后的產(chǎn)物進行自動測序儀測定，只有末端帶有熒光性標(biāo)記的片段能被檢測并可用T-RFs反映了微生物群落的組成情況。因此可用全部帶有熒光的T-RFs的長度和豐度代表群落結(jié)構(gòu)的多樣性。
1.2 T-RFLP 分析腸道微生物的主要步驟
T-RFLP分析腸道微生物的主要步驟包括：（1）DNA的提取；（2）標(biāo)記引物分子PCR擴增；（3）擴增產(chǎn)物的純化、酶切；（4）結(jié)果測定及分析。
1.3 T-RFLP 技術(shù)評價
隨著T-RFLP的廣泛運用，T-RFLP技術(shù)在關(guān)鍵環(huán)節(jié)上的不足也被暴露出來，本部分主要將T-RFLP技術(shù)與另一指紋圖譜技術(shù)DGGE的優(yōu)缺點進行比較（表1）。
2 技術(shù)在腸道微生物研究方面的應(yīng)用
2.1 T-RFLP 的實驗對象的發(fā)展
嚙齒類動物、哺乳動物、環(huán)節(jié)動物、魚類、禽類和人類等均可作為T-RFLP檢測的實驗對象。T-RFLP早年的實驗對象多為魚類、禽類、嚙齒類動物、哺乳類動物等，自2012年至今，T-RFLP研究領(lǐng)域不斷拓寬，從大鼠，小鼠等實驗動物階段到廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)以及野生動物保護研究。隨后， T-RFLP技術(shù)被大量運用于與人體相關(guān)的飲食因素，疾病研究當(dāng)中。Akira Andoh等[4]通過將患者與健康受試者腸道的微生物組成進行組間及組內(nèi)對比后發(fā)現(xiàn)患者與受試者，發(fā)現(xiàn)病人腸道內(nèi)含有健康個體沒有的胃瘤球菌屬、真細菌、梭菌、γ-變形菌、非典型的擬桿菌和非典型乳桿菌，得出克萊恩�。–rohn'sdisease）與腸道菌群的`組成有關(guān)系。Katsuyuki Fukuda等[5]通過對患不同類型化膿性大腸炎病人的腸道微生物進行T-RFLP分析，再對其結(jié)果進行線性判別分析并計算出判別系數(shù)后發(fā)現(xiàn)，判別系數(shù)與化膿性大腸炎的活動性程度有關(guān)，提示可以通過判別系數(shù)DS對化膿性大腸炎的活動性進行預(yù)測與判斷。
2.2 T-RFLP 具體方法的應(yīng)用發(fā)展
T-RFLP的方法分為單熒光T-RFLP和雙熒光T-RFLP,張慧等[6]建立的雙熒光T-RFLP在準確性和靈敏性方面，與傳統(tǒng)T-RFLP技術(shù)相比基本一致或優(yōu)于。通過參數(shù)優(yōu)化，可以在保證準確度的前提下，獲得較高的靈敏度。由于單熒光T-RFLP成本低廉，檢測結(jié)果的準確性和靈敏度可以滿足大多數(shù)實驗要求，近些年，大部分研究使用的均為單熒光T-RFLP.
T-RFLP檢測過程涉及引物、酶、熒光素等。常見的真菌引物為ITS1F、ITS4R,古生菌引物為Ar3f、Ar927r,常用的細菌引物為27F、8F、63F、7F、1492R、1510R等，熒光一般標(biāo)記27F、8F、63F引物的5’端，其中27F和8F最為常用。目前常用的熒光物質(zhì)有6-羧基熒光素、NED、Cy5、D4熒光素等。T-RFLP技術(shù)一般用引物擴增細菌片段16Sr RNA和16Sr DNA,真菌的擴增片段是ITS序列，古生菌為16Sr RNA.用于酶切PCR擴增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶較多，其中Msp I、Hha I、Hae III、Rsa I比較常用；隨著T-RFLP技術(shù)的發(fā)展，限制性內(nèi)切酶種類也越來越多，近兩年相繼出現(xiàn)了實驗使用限制性內(nèi)切酶Bfa I和Alu I.
2.3 腸道菌群數(shù)據(jù)分析方法進展
可用于T-RFLP數(shù)據(jù)分析的方法較多。原始T-RFLP數(shù)據(jù)可以利用TAP-T-RFLP和T-RFPred等在線工具，用一些抑制酶和其相關(guān)的“T-RFs”模式的預(yù)測對16Sr RNA基因（庫）進行電子消化后分析。最近，一些應(yīng)用如系統(tǒng)賦值工具（PAT），T-對齊（T-Align），ARB集成軟件工具，TRF-CUT,TRi FLe和T-RFLP統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析軟件[7]等被運用的較多，其可用于完成剖面對比、樹狀圖形式等任務(wù)從而對數(shù)據(jù)和相似性的表達進行統(tǒng)計分析。在眾多分析方法中，一般而言，PCA,MDS,SOM和AMMI推薦用于群落成員之間相似性和差異性的可視化處理；集群分析和貝葉斯分析用于分群鑒定；CCA和RDA用于將微生物群落變化與環(huán)境的變化聯(lián)系起來[8].
3 技術(shù)前景展望
T-RFLP技術(shù)盡管還存在不足，但毋庸置疑，其仍然是現(xiàn)今最好的分析微生物群落結(jié)構(gòu)的工具之一。將來，隨著16Sr RNA基因序列數(shù)據(jù)庫和引物的改進，數(shù)據(jù)生成和分析過程中精制協(xié)議和統(tǒng)計工具的運用以及分析方法的分辨率和分析技術(shù)的不斷提高，T-RFLP最終將能在腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，微生物與環(huán)境、宿主之間的關(guān)系等方面將發(fā)揮更大的作用。隨著時間的推移，我們有理由相信T-RFLP技術(shù)將會越來越成熟，也將在人腸道菌群與人類健康的研究領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。
參考文獻：
[1]Osborn AM, Moore ERB, Timmis KN （1999） An evaluation ofterminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）analysis for the study of microbial community dynamics. EnvironMicrobiol,2000（1）：39-50.
[2]孫慶華，柏耀輝，趙翠 等。DGGE、T-RFLP、LH-PCR 對兩種活性污泥的微生物種群多樣性分析的比較[J].環(huán)境工程學(xué)報，2009（8）：1365-1369.
[3]Osborn AM, Moore ERB, Timmis KN （1999） An evaluation ofterminal restriction fragment length polymorphism （T-RFLP）analysis for the study of microbial community dynamics. EnvironMicrobiol,2000（1）：39-50.
[4]Akira Andoh,Toshio Kobayashi et al.;Characterization of gutmicrobiota profiles by disease activity in patients with Crohn'sdisease using data mining analysis of terminal restrictionfragment length polymorphisms;Biomedical Reports 2014（2）：370-373.
[5]Katsuyuki Fukuda,Yoshiyuki Fujita;Determination of the dis-criminant score of intestinal microbiota as a biomarker ofdisease activity in patients with ulcerative colitis;BMC Gas-troenterology 2014（14）：49.
[6]張惠。雙熒光 T-RFLP 方法的建立及應(yīng)用[D].大連海事大學(xué)，2012.
[7]Ricke P, Kolb S, Braker G Application of newly developed ARBsoftware- integrated tool for in silico terminal restrictionfragment length polymorphism analysis reveals the dominanceof a novel pmo A cluster in forest soil. Appl Environ Microbiol,2005（71）：1671-1673.
[8]Hugenholtz P, Goebel BM, Pace NR Impact of culture indepen-dent studies on the emerging phylogenetic view of bacterialdiversity. J Bacteriol,1998（180）：4765-4774.
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