蛋白質(zhì)

　　3、“分子運(yùn)輸車”——載體

　�。�1）載體具備的條件：

　　①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。

　�、诰哂幸恢炼鄠�(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA的片段插入。

　�、劬哂袠�(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。

　　（2）最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的`、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。

　�。�3）其它載體：λ噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒。

　　基因工程的基本操作程序

　　第一步：目的基因的獲取

　　1、目的基因是指：編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。

　　2、原核基因采取直接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。

　　3、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

　�。�1）PCR的含義：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的片段的核酸合成技術(shù)。

　　（2）目的：獲取大量的目的基因

　�。�3）原理：DNA雙鏈復(fù)制

　�。�4）過程：

　　第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈為單鏈；

　　第二步：冷卻到55～60℃，引物與兩條單鏈DNA結(jié)合；

　　第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始進(jìn)行互補(bǔ)鏈的合成。

　�。�5）特點(diǎn)：指數(shù)（2n）形式擴(kuò)增

　　第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）

　　1。目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

　　2。組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因

　�。�1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA的片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。

　�。�2）終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA的片段，位于基因的尾端。

　�。�3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。

　　第三步：將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞

　　1、轉(zhuǎn)化的概念：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

　　2、常用的轉(zhuǎn)化方法：

　　將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有基因槍法和花粉管通道法等。

　　將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)。方法的受體細(xì)胞多是受精卵。

　　將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞：原核生物作為受體細(xì)胞的原因是繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，最常用的原核細(xì)胞是大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化方法是：

　　先用Ca2+處理細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，再將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程。

　　3、重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。

　　第四步：目的基因的檢測(cè)和表達(dá)

　　1、首先要檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子雜交（DNA—DNA）技術(shù)。

　　2、其次還要檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA，方法是采用分子雜交（DNA—RNA）技術(shù)。

　　3、最后檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是采用抗原—抗體雜交技術(shù)。

　　4、有時(shí)還需進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如生物抗蟲或抗病的鑒定等。

　　高中選修一生物知識(shí)

　　DNA的粗提取與鑒定

　　提取DNA的溶解性原理包括DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

　　DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度的特點(diǎn)：在0.14mol/L時(shí)溶解度最��；要使DNA溶解，需要較高濃度？要使DNA析出，又需要0。14mol/L的濃度？

　　在溶解細(xì)胞中的DNA時(shí)，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機(jī)溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特別是95%冷卻酒精），但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。

　　從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。

　　采用DNA不溶于酒精的原理，可以達(dá)到的目的是：將DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。

　　提取DNA還可以利用DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時(shí)，應(yīng)選用蛋白酶，因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍�，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60～80℃，因?yàn)樵摐囟戎档鞍踪|(zhì)變性沉淀，而DNA不會(huì)變性。

　　補(bǔ)充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在95℃。

　　當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時(shí)，需要使用什么指示劑進(jìn)行鑒定？

　　答：在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。

　　原理總結(jié)：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細(xì)胞中提取和提純DNA；再利用酒精進(jìn)一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來，達(dá)到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。

　　實(shí)驗(yàn)材料的選取：

　　不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時(shí)，應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。

　　本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。

　　雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。

　　破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液。

　　若選用雞血和洋蔥作實(shí)驗(yàn)材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？

　　答：在雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。

　　為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？

　　答：蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA。