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真菌培養(yǎng)及鑒定方法有哪些
真菌的營養(yǎng)要求不向。在一般細(xì)菌培養(yǎng)基上均能生長。真菌培養(yǎng)及鑒定有哪些的呢?本文是小編整理真菌培養(yǎng)及鑒定的資料，僅供參考。
真菌培養(yǎng)及鑒定
1.采集標(biāo)本 體表真菌的標(biāo)本有毛發(fā)、皮屑、甲屑、痂等，標(biāo)本在分離前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的標(biāo)本可根據(jù)情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰-道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標(biāo)本應(yīng)注意無菌操作。
2.培養(yǎng)檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標(biāo)本接種于葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud agar)上，置室溫或37℃培養(yǎng)1～3周。必要時(shí)可行小培養(yǎng)協(xié)助鑒定。菌種鑒定常根據(jù)菌落的形態(tài)及顯微鏡下形態(tài)判斷。對某些真菌，有時(shí)尚需配合其他鑒別培養(yǎng)基、生化反應(yīng)、分子生物學(xué)方法確定。
真菌培養(yǎng)的方法與直接鏡檢法相比較而言，更能對大部分真菌感染的灰指甲作出準(zhǔn)確的鑒定，也是診斷灰指甲的一個(gè)很重要的手段。下面我們就從培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)時(shí)間、菌種鑒定三方面來了解一下灰指甲的真菌培養(yǎng)法。
1.培養(yǎng)基的選擇
通常培養(yǎng)真菌會同時(shí)選用兩種培養(yǎng)基，如果單用一種培養(yǎng)基，則容易忽略其它種類的真菌診斷。常見的兩種培養(yǎng)基，一種為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中加抗菌劑，常為氯霉素和放線菌酮;另一種是沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中僅加氯霉素，不加放線菌酮。
2.培養(yǎng)時(shí)間
各種真菌的生長速度不同，所以報(bào)告的時(shí)間也不同。一般皮膚癬菌生長較緩慢，在26℃-28℃的環(huán)境下需要培養(yǎng)2-4周才能發(fā)報(bào)告，但是，皮膚癬菌含蓋的菌種較多也需要區(qū)別對待;酵母菌生長較快，通常2-3就可以發(fā)報(bào)告，如果為陰性則需要觀察1周;霉菌生長也比較快，一般2-4天就可以發(fā)報(bào)告。
3.菌種鑒定
(1)絲狀真菌：包括皮膚癬菌和霉菌，根據(jù)菌落形成所需要的時(shí)間，在不同條件下生長的情況，菌落表面及背面的形態(tài)、色素，培養(yǎng)基中有無色素，培養(yǎng)物用乳酚棉藍(lán)染色后鏡檢找特征性標(biāo)志結(jié)構(gòu)。(2)酵母菌：分為形態(tài)學(xué)鑒定及生化試驗(yàn)。形態(tài)學(xué)鑒定主要觀察有無假菌絲產(chǎn)生，如有則為念珠菌屬，如無則為念珠菌以外的酵母菌;生化試驗(yàn)最為常用的是API系統(tǒng)，用此法鑒定準(zhǔn)確，但價(jià)格較貴。
)絲狀真菌：主要是形態(tài)學(xué)的鑒定，如直接涂片觀察，小培養(yǎng)顯微鏡鑒定，誘導(dǎo)形態(tài)觀察(25℃與35℃下雙相型真菌的特征孢子及菌絲的產(chǎn)生和兩種菌落的形成及腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，KT培養(yǎng)基，KelleyAgar培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相誘導(dǎo)，另外常用的還有皮膚癬菌VB1生長刺激，吳氏熒光檢查，毛發(fā)穿孔試驗(yàn)及在特殊情況下進(jìn)行的一些生化鑒定等。其中，小培養(yǎng)顯微鏡檢對于絲狀真菌的鑒定，特點(diǎn)是動態(tài)直觀，易于觀察，且節(jié)約材料。解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科馬天
(2)酵母菌鑒定：形態(tài)學(xué)鑒定主要是玉米吐溫誘導(dǎo)下特征菌絲及特征孢子的檢驗(yàn)，血清芽管形成，而在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上還必須進(jìn)行生化鑒定：有標(biāo)準(zhǔn)鑒定，自動儀器鑒定，顯色鑒定，其中，自動儀器鑒定(如API20C，ID32C等)，顯色鑒定對于酵母樣真菌的鑒定，特點(diǎn)是快速簡便;標(biāo)準(zhǔn)鑒定是按傳統(tǒng)雙歧表流程鑒定(包括糖同化試驗(yàn)，糖發(fā)酵試驗(yàn)，CAFC酚氧化酶試驗(yàn)，尿酶試驗(yàn)，KNO3同化試驗(yàn)，脂肪酸需求試驗(yàn))，是真菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，系統(tǒng)準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是程序繁瑣，耗時(shí)長，與臨床治療不太適應(yīng)。此外，還有血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)，動物致病性實(shí)驗(yàn)，分子生物學(xué)鑒定：如核酸雜交，DNA探針雜交，PCR擴(kuò)增序列分析，PCR-SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，PCR-RFLP限制性片段長度多態(tài)性分析，PCR-RAPD隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析，PFCG脈沖電泳核型分析等。
對于酵母樣真菌首選CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基，而顯色培養(yǎng)基不能鑒定的酵母樣真菌可采用自動儀器YBC卡進(jìn)行鑒定或API板;條件較差的實(shí)驗(yàn)室可采用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)鑒定法中鑒定值較高的試驗(yàn)，如酚氧化酶鑒定新型隱球菌(+)，尿素區(qū)分毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(-)，念珠菌屬(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(+)，玉米-土溫培養(yǎng)基上產(chǎn)菌絲區(qū)分念珠菌屬(+)與球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(-)與毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(+)。而同化試驗(yàn)推薦平皿法，一個(gè)平皿內(nèi)可觀察多種糖類的同化情況，且結(jié)果易于觀察，重復(fù)性好。對于絲狀真菌及雙相型真菌，可采用小培養(yǎng)法，快速簡便易于觀察。而對于雙相型真菌還須經(jīng)過腦心浸液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)相試驗(yàn)后確證。而血清學(xué)及分子生物學(xué)則主要用于流行病學(xué)和一些難培養(yǎng)難鑒定真菌的檢驗(yàn)，由于成本高或要求技術(shù)難度較高，故而不適合在常規(guī)工作中采
真菌的培養(yǎng)特性
真菌的營養(yǎng)要求不向。在一般細(xì)菌培養(yǎng)基上均能生長。檢查時(shí)常用沙保培養(yǎng)基。此培養(yǎng)基成分簡單，主要含有1%蛋白陳、4%葡萄糖和2%瓊脂，pH佰55.皮膚癬拘在此培養(yǎng)基上生長較慢，常需1～4周;世腐生性真構(gòu)在此培養(yǎng)基上生長迅速。故分離真菌時(shí)常在此培養(yǎng)基戶加一定量的放線菌酮和氯霉素，前者用于抑制污染真菌，后者用于抑制細(xì)慚的生長。有些病原性真菌，如白假絲酵球菌、組織腦漿茵、新生隱球菌竿加放線菌酮即不能生良，故宜用力抗生京的血瓊脂平板，見有生長后移種沙保培養(yǎng)基，并問時(shí)做玻片培養(yǎng)以觀察其自然狀態(tài)下的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 培養(yǎng)真菌最適宜的酸堿度是PH值4.0～6.0，淺部感染真菌的最道溫度為22～28℃，但某些誅部感染真菌一般在37℃牛長最好。培養(yǎng)真菌需較尚的濕度與氧。
真菌的培養(yǎng)方法
玻片培養(yǎng)又稱小培養(yǎng)，小培養(yǎng)法可以隨時(shí)觀察真菌的生長形態(tài)(如大分生孢子、小分生孢子及孢子柄等)，還可以隨時(shí)觀察其生長發(fā)育的全部情況，有利于菌種的鑒定。
1、鋼環(huán)法
(1)材料：白假絲酵母菌、沙保弱培養(yǎng)基、無菌玻片、蓋玻片、鋼環(huán)(帶有缺 口)、石蠟。
(2)方法
�、儆脽o菌鑷子取無菌小培養(yǎng)鋼環(huán)，環(huán)的兩面分別蘸取熔化的固體石蠟，平置于無菌載玻片上，另取一無菌蓋玻片，在酒精燈火焰上加熱后覆蓋于鋼環(huán)上，待冷后，小培養(yǎng)鋼圈即被固定于載玻片與蓋玻片之間。
②用毛細(xì)滴管吸取融化的培養(yǎng)基，從鋼環(huán)上端孔注入，注入量占容積的1/2即可。
�、叟囵B(yǎng)基冷卻凝固后，用接種針挑取材料，由上端孔接種于環(huán)內(nèi)培養(yǎng)基上。
④置濕盒內(nèi)，室溫或37℃下培養(yǎng)2—3d后，逐日觀察，鏡下可連續(xù)看到真菌生長過程及菌絲、孢子等特征，一般7d左右即可長好。
�、菀部刹挥眯∨囵B(yǎng)鋼環(huán)，直接將融化的培養(yǎng)基滴于無菌玻片上，待冷凝后從周邊接種材料，用蓋玻片覆蓋后培養(yǎng)，在顯微鏡下連續(xù)觀察生長情況。
(3)結(jié)果：鏡下觀察可見到有胞壁增厚的厚膜孢子及假菌絲。
2、小塊瓊脂玻片培養(yǎng)法
用無菌操作法將制好的待用瓊脂平板用無菌接種針或接種環(huán)切成大約1cm2的方塊，將其放置于滅菌的載玻片上。將標(biāo)本或待檢菌接種于瓊脂塊四周邊緣靠上方部位，然后用無菌鑷子取一無菌的蓋玻片蓋在瓊脂上。在無菌平皿內(nèi)放入少量無菌水和一個(gè)無菌U形(或V形)玻璃棒。將此載玻片置于玻璃棒上，蓋上平皿蓋培養(yǎng)。每日用肉眼和顯微鏡觀察孢子和菌絲的特點(diǎn)。
拓展內(nèi)容
生物學(xué)真菌的形態(tài)特征
與細(xì)菌相比，真菌的大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成均有很大的差異。真菌比細(xì)菌大幾倍至幾十倍，可以用普通光學(xué)顯微鏡觀察。真菌的細(xì)胞是典型的真核細(xì)胞，真菌細(xì)胞具有細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、細(xì)胞器及細(xì)胞質(zhì)。真菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分為幾丁質(zhì)(chitin)和1，3-葡聚糖，而細(xì)菌細(xì)胞壁主要化學(xué)成分為肽聚糖。真菌按形態(tài)可分為單細(xì)胞和多細(xì)胞兩類。單細(xì)胞真菌主要為酵母菌(yeast)和酵母樣菌(veast-1ike)，菌體呈圓形或卵圓形，其形成的菌落為酵母型或類酵母型，臨床常見的有念珠菌屬和新生隱球菌。多細(xì)胞真菌由菌絲和孢子組成，菌絲伸長分支，交織成團(tuán)形成菌絲體(mycelium)，并長有各種孢子，這類真菌稱為絲狀菌(filamentousfungus)，俗稱霉菌(mold)。其形成的菌落為絲狀型。對人致病的有皮膚癬菌等。有些真菌可因營養(yǎng)、溫度、氧氣等環(huán)境條件的改變，而兩種形態(tài)發(fā)生互變，稱為二相性(dimorphic)。真菌的菌落形態(tài)、顏色變化及真菌不同生長時(shí)期的鏡下特征是正確鑒定真菌的重要依據(jù)。
(一)真囂的鏡下形態(tài)
多細(xì)胞真菌的菌絲和孢子隨真菌種類不同而形態(tài)不同，是鑒別真菌的重要依據(jù)。
1.菌絲是由孢子出芽形成的。孢子在環(huán)境適宜的條件下長出芽管，逐漸延長呈絲狀即菌絲(hyphae)。當(dāng)菌絲不斷生長、分支并交織成團(tuán)時(shí)，被稱為菌絲體(mycelium)。孽警粵結(jié)構(gòu)不同可分為有隔菌絲和無隔菌絲。有隔菌絲(septatehyphae)是由橫隔將管狀尊構(gòu)的菌絲分隔成一連串多樣的絲狀體，如曲霉、青霉和毛癬菌等大多數(shù)絲狀真菌的菌絲屬于此類：無隔菌絲
無隔膜，整條菌絲為單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有多個(gè)細(xì)胞核，根霉和毛霉的菌絲屬于此類。菌絲在人工培養(yǎng)基中生長，按其著生情況可分為營喬麗絲(vegetativehyphae)和氣生菌絲(aerialhyphae)。菌絲向下生長，深入培養(yǎng)基內(nèi)獲取營養(yǎng)的菌絲稱為營養(yǎng)菌絲：而從培養(yǎng)基表面長出向空中伸展的菌絲稱為氣生菌絲。部分氣生菌絲發(fā)育到一定階段可衍化為具有繁殖能力的繁殖菌絲(reproductivehyphae)。菌縫可有多種形態(tài)，如螺旋狀、球拍狀、結(jié)節(jié)狀、鹿角狀、梳狀和關(guān)節(jié)狀等，它們有助于真菌的鑒別。
2.孢子是的繁殖結(jié)構(gòu)，分為有性孢子和無性孢子兩類。有性孢子是由同一里體璧不同菌體上的兩個(gè)細(xì)胞融臺經(jīng)減數(shù)分裂形成。無性孢子由菌絲上的細(xì)菌直接分化或出芽形成，是病原性真菌傳播和延續(xù)后代的主要方式。真菌孢子抵抗力不強(qiáng)，加熱60～70℃短時(shí)間即死亡。真菌孢子與細(xì)菌芽胞不同，其區(qū)別見表22-1。
(1)無性孢子：無性孢子根據(jù)形態(tài)分為分生孢子、葉狀孢子和孢子囊孢子三種。
①分生孢子：分生孢子是真菌中最常見的一種無性孢子。它首先在繁殖菌絲的末端分化形成分生孢子梗，然后在梗上產(chǎn)生分生孢子。按其形態(tài)和結(jié)構(gòu)可分為大分生孢子和小分生孢子。大分生孢子(macroconidium)體積較大，分隔成較多細(xì)胞，常呈梭形、棍棒型或梨形。其大小、細(xì)胞數(shù)和顏色是鑒定真菌的重要依據(jù)。小分生孢子體積較小，單細(xì)胞性，外壁薄，有球形、卵形、梨形以及棍棒狀等各種不同形態(tài)。真菌都能產(chǎn)生小分生孢子，其診斷意義不大。
�、谌~狀孢子(thallospore)：葉狀孢子是由菌絲細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚咦樱醒可咦�、關(guān)節(jié)孢子和厚膜孢子三種。芽生孢子(blastospore)由菌細(xì)胞直接出芽而形成，如酵母菌。芽生孢子長到一定大小一般會與母體脫離，若不與母體脫離，便延長呈絲狀，形成假菌絲，多數(shù)念珠菌屬菌種可形成假菌絲。關(guān)節(jié)孢子
(arthroconidium)是由菌絲生長到一定階段后，出現(xiàn)很多橫隔膜，然后從橫膈膜處斷裂形成矩形、筒形或短柱狀的孢子。如毛孢子菌、球孢子菌等。厚膜孢子(chlamydospore)由菌絲內(nèi)胞漿濃縮，壁增厚，為躲避不利環(huán)境而形成的休眠細(xì)胞。當(dāng)條件適宜時(shí)又可出芽繁殖。如白色念珠菌、絮狀表皮癬菌等可產(chǎn)生。
�、坻咦幽益咦�(sporangiospore)：孢子囊孢子由菌絲末端膨大形成囊狀結(jié)構(gòu)即孢子囊。其內(nèi)密集許多細(xì)胞核，每個(gè)核都被細(xì)胞質(zhì)包圍，分隔割裂成塊，并逐漸形成孢子壁，最終成為孢子囊孢子。毛霉菌、根霉菌等絲狀真菌和酵母樣真菌可產(chǎn)生此類孢子。
(2)有性孢子：有性孢子分為卵孢子、接合孢子、子囊孢子和擔(dān)孢子。多見于非致病性
(二)真菌的菌落特征
多數(shù)真菌的培養(yǎng)條件要求不高，在培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)主要有以下兩種。
1．酵母型菌落形態(tài)與一般細(xì)菌菌落相似，但較大些，表面光滑、濕潤、柔軟、邊緣整齊、奶酪樣。菌細(xì)胞以單細(xì)胞芽生方式繁殖，不形成真、假菌絲。新生隱球菌的菌落屬于此型。有些單細(xì)胞性真菌孢子出芽形成芽管，芽管延長不
與母細(xì)胞脫離，形成假菌絲。假菌絲由菌落向培養(yǎng)基深部生長，這種菌落稱為類酵母型(或酵母樣)菌落，如念珠菌屬的多數(shù)菌種。
2．絲狀型菌落是多細(xì)胞真菌的菌落形式，由許多管狀、分支的菌絲體和分生孢子組成。菌落呈羊毛狀、鵝毛狀、棉絮狀、絨毛狀和粉末狀，正、反面呈不同的顏色。曲霉、青霉、毛霉和皮膚癬菌等的菌落屬于此型。絲狀型菌落的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和顏色常作為鑒別真菌的依據(jù)。
二相性真菌在35~37℃條件下培養(yǎng)，在體內(nèi)或在含動物蛋白的培養(yǎng)基上可形成酵母型菌落；在22～28℃條件下培養(yǎng)，在普通培養(yǎng)基上可形成絲狀型菌落，如馬爾尼菲青霉菌、粗球孢子菌、副球孢子菌和申克孢子絲菌等。
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