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雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的一些影響因素及注意事項(xiàng)

　　1．報(bào)告基因檢測(cè)受多種因素影響（載體狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率、加樣精度、檢測(cè)過(guò)程等），因此同批次樣品檢測(cè)值也可能出現(xiàn)浮動(dòng)。所以實(shí)驗(yàn)一般需要做3個(gè)或3個(gè)以上復(fù)孔，并且引入另一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)參。

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的一些影響因素及注意事項(xiàng)

　　2．細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，12-36h內(nèi)最好；長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后，細(xì)胞難裂解。

　　3．雙熒光素酶報(bào)告基因的載體選擇：

　　a)螢火蟲(chóng)熒光素酶建議選取pGL-3或pGL-4的載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體；

　　b)海腎熒光素酶建議選取phRL-TK或pGL-4代載體或自己構(gòu)建相應(yīng)的載體。建議海腎載體不使用強(qiáng)啟動(dòng)子（如SV40、CMV），而選用中等強(qiáng)度的啟動(dòng)子（如TK）。

　　4．雙熒光素酶報(bào)告基因的載體比例：根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整。建議作一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)調(diào)整（螢火蟲(chóng)載體與海腎載體比例分別用1：10、1：20、1：50、1：100），螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)發(fā)光值大于海腎熒光素酶發(fā)光值的比例較好。

　　5．最適反應(yīng)溫度：室溫（20-22℃）。各個(gè)組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫。

　　6．雙熒光素酶反應(yīng)體積：20ul（細(xì)胞裂解產(chǎn)物）-100ul（螢火蟲(chóng)熒光素酶底物）-100ul（海腎熒光素酶底物），底物量可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，但一定要保證底物過(guò)量，不然會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)大的偏差

　　7．細(xì)胞裂解產(chǎn)物存放：常溫不超過(guò)6小時(shí)；-20℃一個(gè)月；-80℃半年

　　8．裂解產(chǎn)物與底物混合（手動(dòng)加樣）：要求混合快速、混合時(shí)間一致，避免熒光素酶衰變的影響。

　　9．發(fā)光半衰期：

　　a)單熒光素酶檢測(cè)試劑盒（E1500），螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)光半衰期約12min

　　b)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（E1910），螢火蟲(chóng)熒光素酶的發(fā)光半衰期約9min，海腎熒光素酶的發(fā)光半衰期約2min

　　10．檢測(cè)結(jié)果

　　檢測(cè)前應(yīng)檢測(cè)孔板或空管的發(fā)光值，作為儀器發(fā)光背景值，Modulus多功能檢測(cè)儀的儀器背景值應(yīng)小于100；

　　樣品檢測(cè)發(fā)光值應(yīng)該遠(yuǎn)大于儀器背景值，例如10000。如果樣品發(fā)光值過(guò)于接近儀器背景值，說(shuō)明樣品中熒光素酶過(guò)少，需要考慮轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率等因素。

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