關(guān)于生物嘌呤的知識(shí)

　　嘌呤霉素殺滅曲線的確定（shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，僅作參考）

　�。�1）24孔板內(nèi)以5~8x104cells/孔的密度鋪板，鋪?zhàn)銐蛄康目滓赃M(jìn)行后續(xù)的梯度實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞孵育過夜；（2）準(zhǔn)備篩選培養(yǎng)基-含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15μg/mL，至少5個(gè)梯度）；

　�。�3）細(xì)胞孵育過夜后加入篩選培養(yǎng)基，孵育細(xì)胞；

　�。�4）約2-3天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基；

　�。�5）每日監(jiān)測細(xì)胞觀察存活細(xì)胞比例。嘌呤霉素的'最佳作用時(shí)間一般在1-4天之間。

　　（6）最小的抗生素使用濃度就是指從抗生素篩選開始1-4天內(nèi)殺死所用細(xì)胞的最低篩選濃度。

　　嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞

　　（1）day0：24孔板內(nèi)以5~8x104cells/孔的密度鋪板，孵育過夜；

　�。�2）制備篩選培養(yǎng)基：含有最佳篩選濃度嘌呤霉素（由殺滅曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基；

　�。�3）day1：篩選第一天，去除舊的培養(yǎng)基，加入一定量MOI的病毒顆粒；（加入無血清培養(yǎng)基的總量必須充分覆蓋住細(xì)胞。）

　�。�4）病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后約6-8h，再添加1ml完全培養(yǎng)基（血清和雙抗，如果已經(jīng)使用雙抗。）到細(xì)胞內(nèi)，然后孵育過夜；

　　（5）病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h，使用嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基替換舊的完全培養(yǎng)基。孵育。

　�。�6）約每2-3天替換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基；

　�。�7）每天檢測細(xì)胞并觀察活細(xì)胞生長比例，以及turboGFP表達(dá)的水平及所占比例。在某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)幾乎所用存活細(xì)胞都可以表達(dá)TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用時(shí)間在3-10天之間。

　　注：病毒的MOI越高，每個(gè)細(xì)胞含有的shRNA拷貝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素篩選時(shí)，需記住越高M(jìn)OI,含越多pac拷貝的細(xì)胞能耐受更高的嘌呤霉素濃度。調(diào)整嘌呤霉素的濃度去篩選預(yù)定量的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，但是嘌呤霉素的量不能低于殺死曲線建立的最低濃度。

　　儲(chǔ)存方法和穩(wěn)定性：

　　嘌呤霉素穩(wěn)定性高，可以常溫運(yùn)輸，收到產(chǎn)品后4℃存放；

　　嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個(gè)月，4℃條件下保質(zhì)期一年。為了達(dá)到最理想的穩(wěn)定狀態(tài)和最長的保質(zhì)期，最好存放于-20°C，保質(zhì)期為2年。

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