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dna聚合酶的特點(diǎn)及其作用

　　dna聚合酶的特點(diǎn)：

　　[1]以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;

　　[2]需要模板和引物的存在;

　　[3]不能起始合成新的DNA鏈;

　　[4]催化dNTP加到生長中的DNA鏈的3-OH末端;

　　[5]催化DNA合成的方向是5→3。

　　dna聚合酶的作用：

　　[1]聚合作用：在引物RNA-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個(gè)將核苷酸

　　加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的專一性主要表現(xiàn)為新進(jìn)入的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對(duì)時(shí)才有催化作用。dNTP進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)后，可能使酶的構(gòu)象發(fā)生變化，促進(jìn)3-OH與5-PO4結(jié)合生成磷酸二酯鍵。若是錯(cuò)誤的核苷酸進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)，則不能與模板配對(duì)，無法改變酶的構(gòu)象而被3-5外切酶活性位點(diǎn)所識(shí)別并切除之。

　　[2]3→5外切酶活性──校對(duì)作用：這種酶活性的主要功能是從3→5方向識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長鏈末端的核苷酸。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有反應(yīng)底物dNTP時(shí)，由于沒有聚合作用而出現(xiàn)暫時(shí)的游離現(xiàn)象，從而被3→5外切酶活性所降解。如果提高反應(yīng)體系的溫度可以促進(jìn)這種作用，這表明溫度升高使DNA生長鏈3末端與模板發(fā)生分離的機(jī)會(huì)更多，因而降解作用加強(qiáng)。當(dāng)向反應(yīng)體系加入了dNTP，而且只加放與模板互補(bǔ)的上述核苷酸才會(huì)使這種外切酶活性受到抑制，并繼續(xù)進(jìn)行DNA的合成。由此推論，3→5外切酶活性的主要功能是校對(duì)作用，當(dāng)加入的核苷酸與模板不互補(bǔ)而游離時(shí)則被3→5外切酶切除，以便重新在這個(gè)位置上聚合對(duì)應(yīng)的核苷酸。在某些T4噬菌體突變株中DNA復(fù)制的真實(shí)性降低，而易發(fā)生突變，從此突變株分離得到的T4DNA聚合酶的3→5外切酶活性很低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的T4DNA聚合酶的3→5外切酶活性比野生型高得多，因此，其DNA復(fù)制真實(shí)性好，變異率低�？梢�，3→5外切酶活性對(duì)DNA復(fù)制真實(shí)性的維持是十分重要的。

　　[3]5→3外切酶活性──切除修復(fù)作用：5→3外切酶活性就是從5→3方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5-脫氧核苷酸。這種酶活性只對(duì)DNA上配對(duì)部分(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5→3。每次能切除10個(gè)核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5→3外切酶活力達(dá)10倍以上。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起著重要作用。對(duì)岡崎片段5末端RNA引物的去除依賴此種外切酶活性。

　　[4]焦磷酸解作用：DNApolⅠ的這種活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。這種作用就是無機(jī)焦磷酸分解DNA生長鏈，可以認(rèn)為是DNA聚合作用的逆反應(yīng)，而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA

　　[5]焦磷酸交換作用：催化dNTP末端的PPi同無機(jī)焦磷酸的交換反應(yīng)。

　　反應(yīng)式為32P32Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA

　　最后兩種作用，都要求有較高濃度的PPi，因此，在體內(nèi)由于沒有足夠高的PPi而無重要意義。

　　DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5→3外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA鏈上的切口向前推進(jìn)，即沒有新的DNA合成，只有核苷酸的交換。這種反應(yīng)叫缺口平移(Nick translation)。當(dāng)雙鏈DNA上某個(gè)磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生切口時(shí)，DNApoIⅠ能從切口開始合成新的DNA鏈，同時(shí)切除原來的舊鏈。這樣，從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈。如果新?lián)饺氲拿撗鹾塑账崛姿釣棣?32P-dNTP，則重新合成的新鏈即為帶有同位素標(biāo)記的DNA分子，可以用作探針進(jìn)行分子雜交實(shí)驗(yàn)。

　　盡管DNApolⅠ是第一個(gè)被鑒定的DNA聚合酶，但它不是在腸桿菌中DNA復(fù)制的主要聚合酶。主要證據(jù)如下：

　　[1]純化的DNApolⅠ催化dNTP摻入的速率為667堿基/分，而體內(nèi)DNA合成速率要比此高二倍數(shù)量級(jí);

　　[2]大腸桿菌的一個(gè)突變株中，此酶的活力正常，但染色體DNA復(fù)制不正常;

　　[3]而在另一些突變株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA復(fù)制卻正常，而且此突變株增加了對(duì)紫外線、烷化劑等突變因素的敏感性。這表明該酶與DNA復(fù)制關(guān)系不大，而在DNA修復(fù)中起著重要的作用。

　　實(shí)驗(yàn)室常用的耐熱DNA聚合酶：

　　耐熱DNA聚合酶多應(yīng)用在PCR技術(shù)中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5-3聚合酶活性，但不一定具有3-5和5-3的外切酶活性。3-5外切酶活性可以消除錯(cuò)配，切平末端;5-3外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同，可以將耐熱DNA聚合酶分為三類：

　　一、普通耐熱DNA聚合酶

　　Taq DNA 聚合酶

　　由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出，是發(fā)現(xiàn)的耐熱DNA聚合酶中活性最高的一種，達(dá)200,000單位/mg。具有5-3外切酶活性，但不具有3-5外切酶活性，因而在合成中對(duì)某些單核苷酸錯(cuò)配沒有校正功能。

　　TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈3加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3突出的單A核苷酸尾;另一方面，在僅有dTTP存在時(shí)，它可將平端的質(zhì)粒的3端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生3端突出的單T核苷酸尾。應(yīng)用這一特性，可實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的T-A克隆法。

　　Tth DNA 聚合酶

　　從Thermus thermophilus HB8中提取而得，該酶在高溫和MnCl2條件下，能有效地逆轉(zhuǎn)錄RNA;當(dāng)加入Mg2+后，該酶的聚合活性大大增加，從而使cDNA合成與擴(kuò)增可用一種酶催化。

　　二、高保真DNA聚合酶

　　pfu DNA 聚合酶

　　是從Pyrococcus furiosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶，它不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可校正PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤，使產(chǎn)物的堿基錯(cuò)配率極低。PCR產(chǎn)物為平端，無3端突出的單A核苷酸。

　　Vent DNA 聚合酶

　　該酶是從Litoralis棲熱球菌中分離出的，不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可以去除錯(cuò)配的堿基，具有校對(duì)功能。

　　三、DNA序列測定中應(yīng)用的耐熱DNA聚合酶

　　Promega公司測序級(jí)TaqDNA聚合酶

　　是在TaqDNA聚合酶的基礎(chǔ)上對(duì)它進(jìn)行修飾，去除5-3外切酶活性，保證測序記過的高度準(zhǔn)確性，可產(chǎn)生強(qiáng)度均一的測序條帶，背景清晰。

　　Bca Best DNA 聚合酶

　　從Bacillus Caldotenax YT-G菌株中提純，并使其5-3外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸長性能優(yōu)越;可抑制DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，可以得到均一的DNA測序帶。

　　Sac DNA 聚合酶

　　從酸熱浴流化裂片菌中分離，無3-5外切酶活性，可用于DNA測序，但測序反應(yīng)中ddNTP/dNTP的比率要高。

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