生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)習(xí)題解答精選

　　綜合實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的濃度測定—Bradford法

　　1．制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定樣品時(shí)，為什么要將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合？

　　答：(1)由于蛋白與考馬斯亮藍(lán)G-250染料的結(jié)合能力不同，縱向倒轉(zhuǎn)混合，充分反應(yīng)。

　　(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白加入的量與考馬斯亮藍(lán)G-250的體積相差懸殊，縱向倒轉(zhuǎn)混合，充分反應(yīng)。

　　2．查閱相關(guān)資料、文獻(xiàn)，舉例說明測定蛋白質(zhì)的濃度的方法有哪幾種，并說明各自的優(yōu)缺點(diǎn)。 答：主要的以下幾種：

　�。�1）微量凱氏（Kjeldahl）定氮法，優(yōu)點(diǎn)是測定準(zhǔn)確率高，可測定不同形態(tài)的樣品。 缺點(diǎn)是測定過程繁瑣。

　　（2）雙縮脲法（Biuret法）

　　優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。

　�。ǎ常〧olin—酚試劑法（Lowry法）

　　此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色的原因是在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

　　(４）考馬斯亮蘭法（Bradford法）

　　考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在波長為595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

　　優(yōu)點(diǎn)：a. 靈敏度高。b 測定快速、簡便，只需加一種試劑。c. 干擾物質(zhì)少。

　　缺點(diǎn)： a 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。b.物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。c. 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。

　　綜合實(shí)驗(yàn)二 （1）酸性磷酸酯酶的提取

　　1、酸性磷酸酯酶在生物體內(nèi)的作用是什么？

　　答：酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase，E.C.3.1.3.2)存在于植物的種子、霉菌、肝臟和人體的前列腺之中，能專一水解磷酸單酯鍵，如水解磷酸苯二鈉生成苯酚和無機(jī)磷。

　　生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)習(xí)題解答

　　綜合實(shí)驗(yàn)二 （2）酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作和初速度的測定

　　1、為什么酶活力應(yīng)該在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行？

　　答：要進(jìn)行酶的活力測定，首先要確定酶的反應(yīng)時(shí)間。酶的反應(yīng)時(shí)間并不是任意規(guī)定的，應(yīng)該在初速度范圍內(nèi)進(jìn)行選擇。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，曲線趨于平坦，曲線的斜率不斷下降，說明反應(yīng)速度逐漸降低。反應(yīng)時(shí)間延長以后底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強(qiáng)。因此，要真實(shí)反映出酶活力的大小，就應(yīng)該在產(chǎn)物生成量與酶反應(yīng)時(shí)間成正比這一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行初速度的測定。換言之，測定酶活力應(yīng)該在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。

　　綜合實(shí)驗(yàn)二 (3) 酶的活力測定

　　1、酶活力測定中為什么各樣品與底物測定的時(shí)間要嚴(yán)格一致？

　　答：本實(shí)驗(yàn)中用磷酸苯二鈉為底物。磷酸苯二鈉經(jīng)過酸性磷酸酯酶作用，水解以后即生成酚和無機(jī)磷，其反應(yīng)式如下：

　　O

　　||

　　C6H6-O-P-ONa + H2O ≒ C6H6-OH + Na2HPO4

　　|

　　ONa

　　由上式可見，當(dāng)有足夠量的底物磷酸苯二鈉存在時(shí)，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的產(chǎn)物酚和無機(jī)磷也越多。反應(yīng)速率只在反應(yīng)的最初一段時(shí)間范圍內(nèi)保持恒定。隨著時(shí)間的延長，底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的升高，使逆反應(yīng)加強(qiáng)。

　　綜合實(shí)驗(yàn)二 (4) 酸性磷酸酯酶分子量的測定SDS-PAGE電泳法

　　1、為什么要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的甘油溶液？甘油及溴酚蘭的作用分別是什么？

　　答：加少許溴酚蘭的目的是作指示劑，用來反映在電泳的過程中樣品蛋白質(zhì)遷移的長度。加入甘油的作用是甘油的密度較大，對樣品中的蛋白質(zhì)起沉淀作用。

　　2、影響遷移率的因素有哪些？

　　答：①SDS的濃度，溶液中的SDS的總量至少要比蛋白質(zhì)的量要高三倍，一般高達(dá)10倍以上。 ②溶液的離子強(qiáng)度，溶液的離子強(qiáng)度應(yīng)較低，最高不能超過0.26，在低離子濃度中SDS單體具有較高的平衡濃度。

　　③二硫鍵是否完全被還原，只有在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被徹底還原的條件下才能準(zhǔn)確測定。在有些情況下，還需要進(jìn)一步將形成的巰基烷基化。

　�、苊看螛悠窚y定必須同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不得利用另一塊電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　生物化學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)習(xí)題解答

　　綜合實(shí)驗(yàn)三 動(dòng)物組織DNA提取及純度檢測

　　1、DNA提取的原理是什么？

　　答：真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，提取DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離和保持DNA分子的完整。提取DNA過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿或異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細(xì)胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。

　　2、試分析DNA樣品不純的原因？

　　答:①裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶解，②各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解，③取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾，④異丙醇,乙醇.NaAC,KAC等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進(jìn)DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀。

　　綜合實(shí)驗(yàn)四 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及外源DNA的'轉(zhuǎn)化

　　1、氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子的原理是什么？

　　答：外源DNA轉(zhuǎn)化是以 E.coli DH5α 菌株為受體細(xì)胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與 pUC18質(zhì)粒共保溫實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。

　　2、影響轉(zhuǎn)化的因素有哪些？

　　答：(1）細(xì)胞生長狀態(tài)和密度：不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。

　　（2）質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。

　�。�3）試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。

　　（4）防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行， 所用器皿， 如離心管， tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。

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